沙门氏菌经常作为研究细菌自噬的生物模型。然而人们很早就注意到, 侵入宿主细胞内的沙门氏菌仅在感染早期有少量细菌会被细胞自噬识别【6】。本研究中，作者猜想沙门氏菌中可能存在调控细菌自噬的蛋白，因此针对这一表型进行转座子筛选。筛选发现sopF突变体的感染大大提高了沙门氏菌被自噬体识别的比例(图1)。也就是说，沙门氏菌中SopF的存在很大程度上抑制了沙门氏菌触发的自噬过程，阻碍了人们早年的研究。SopF是沙门氏菌SPI-1 III型分泌系统的效应蛋白，直接分泌至宿主细胞发挥抑制作用。更有价值的是, SopF可以高效抑制不同种类细菌触发的自噬, 但对经典自噬通路没有抑制作用。正因为SopF的鉴定，为作者研究细菌特异的自噬通路提供了非常好的研究体系。

为了鉴定参与细菌自噬的宿主基因, 作者设计并完成了基于流式细胞荧光分选的CRISPR全基因组筛选。筛选发现V-ATPase复合物对于细菌自噬的发生是必需的 (图2)。V-ATPase定位于很多内膜系统上，主要负责泵质子以维持细胞器的酸性环境。

进一步研究发现，在细菌感染触发自噬的条件下，V-ATPase复合物可以特异结合自噬蛋白ATG16L1。作为对照，经典自噬的激活不能引起二者的结合。依据文献描述, ATG16L1蛋白决定了LC3在细胞中发生脂类修饰的位置【7】。因此, 作者认为V-ATPase复合物介导细菌自噬是由V-ATPase与ATG16L1的相互作用实现的。

V-ATPase复合物又是如何感知细菌感染并诱导细胞自噬发生的呢？在细菌侵染的过程中, 细菌首先被内吞泡包裹处于膜泡结构中, 而细菌可以通过分泌系统或打孔蛋白在内吞泡膜上形成损伤。作者证明，只有当包裹细菌的膜泡完整性被破坏时，处于膜泡上的V-ATPase才能招募ATG16L1, 进而激活LC3的脂质化修饰过程。这一结论也揭示了V-ATPase感知膜结构的完整性的新功能。另外，V-ATPase与ATG16L1的相互作用依赖于ATG16L1 C端的WD40结构域, 但WD40结构域并不参与经典自噬过程 (酵母的Atg16蛋白没有WD40结构域)。

与前文的发现一致，效应蛋白SopF可以特异地抑制细菌感染触发的V-ATPase与ATG16L1相互作用，并且促进沙门氏菌在体内的增殖与扩散。那么SopF是如何发挥抑制作用的呢？通过晶体结构的解析, 作者发现SopF属于ADP-核糖基转移酶家族蛋白。通过设计巧妙的修饰底物富集实验, 作者利用质谱技术再一次证实了V-ATPase在细菌自噬中的重要作用——SopF催化V-ATPase复合物中ATP6V0C亚基的第124位谷氨酰胺发生ADP-核糖基修饰。最后，作者替换细胞中ATP6V0C第124位谷氨酰胺为丙氨酸，V-ATPase不再与ATG16L1结合, 细菌自噬被完全抑制而经典自噬不受影响。

本研究从细菌遗传发现细菌自噬的抑制蛋白SopF出发，一方面利用宿主细胞的遗传学筛选鉴定到V-ATPase复合物, 另一方面通过ADP-核糖基化蛋白组学鉴定出SopF的修饰底物ATP6V0C，最终共同证明V-ATPase-ATG16L1的结合介导细菌自噬通路。宿主细胞巧妙地利用V-ATPase识别细菌感染早期引发的膜泡损伤，激活细菌自噬通路；沙门氏菌也进化出高效的应对机制，即通过分泌效应蛋白SopF特异性修饰V-ATPase，阻断自噬蛋白的招募，逃脱宿主细胞的免疫识别 (图3)。V-ATPase-ATG16L1的发现为细菌自噬的发生机制提供了强有力的实验证据，解答了长期以来关于细菌自噬识别的疑问，也为其他选择性自噬通路的研究提供新的实验思路。

专家点评

王晓晨、张宏（中科院生物物理所）：自噬（autophagy）是真核细胞中一种保守的分解代谢途径。经典的自噬途径可以感知细胞内的营养状态，通过溶酶体非选择性降解部分细胞质及细胞器为细胞生存提供物质和能量【8,9】。同时，自噬还可以选择性降解特定的物质，如受损细胞器、蛋白质聚集体以及细胞内的病原体【10】。自噬降解入侵病原体的过程也被称为异源自噬（xenophagy）【11】。目前人们已发现多种细菌，包括A族链球菌、沙门氏菌等，感染细胞后会被LC3阳性的自噬小体包裹。但是自噬如何识别这些入侵细菌的机制仍不清楚。另外，自噬只能包裹部分胞内细菌（10-20%），其中的原因也尚待研究。

2019年7月18日，北京生命科学研究所邵峰课题组在Cell上发表题为A Bacterial Effector Reveal the V-ATPase-ATG16L1 Axis that InitiateXenophagy 的文章。该研究首次发现沙门氏菌的III型分泌系统（T3SS）效应蛋白，SpoF，可以抑制异源自噬，spoF敲除导致80%的胞内细菌被自噬识别。利用sopF突变菌株诱导异源自噬，邵峰课题组发现宿主细胞的V-ATPase是触发异源自噬的关键因子，其通过招募自噬蛋白ATG16L1启动异源自噬过程，为自噬如何识别外源细菌提供了全新机制。

异源自噬受困于低水平的LC3标记，在病原菌识别及自噬启动机制方面无法开展高效的研究。邵峰课题组另辟蹊径，从细菌入手，鉴定可以抑制异源自噬的细菌效应蛋白，并通过转座子筛选发现了SpoF。SpoF由沙门氏菌的III型分泌系统（T3SS）分泌到宿主细胞质中，特异性地抑制异源自噬，对细菌的入侵及在宿主细胞中的转运没有影响。另外，SpoF不影响经典自噬途径和选择性线粒体自噬。sopF突变菌株感染导致LC3标记的细菌数目大大增加，为异源自噬识别机制的研究打开了大门。

利用sopF突变细菌高效诱导异源自噬这一研究模型，邵峰课题组利用CRISPR/Cas9技术在宿主细胞中进行了非偏好性筛选，发现宿主细胞的V-ATPase是引起异源自噬的关键因子。在V-ATPase的作用机制方面，研究者通过质谱分析发现异源自噬发生时，V-ATPase特异的与自噬蛋白ATG16L1相互作用，并将ATG16L1招募到包含细菌的囊泡表面，从而引起LC3蛋白的脂化并标记此囊泡结构。在SopF存在时，V-ATPase对ATG16L1的招募被阻断，从而抑制异源自噬。研究发现，ATG16L1通过C端包含7个WD40结构域的片段与V-ATPase结合。ATG16L1的这一段结构域在酵母Atg16并不存在，而且这一结构域对经典自噬途径也没有影响【12】。ATG16L1为何在进化过程中多出这一段结构一直是未解之谜，而ATG16L1的炎性肠病克隆氏症（Crohn's disease）相关突变正位于这一区域【13,14】，邵峰课题组的这一发现对于解析ATG16L1的功能，特别是在免疫系统中的作用也具有重要意义。

通过对SopF生化性质的研究，邵峰组发现SopF可催化腺苷核糖基化（ADP-ribosylation）。进一步研究发现SopF可催化V-ATPase亚基ATP6V0C第124位谷氨酰胺（Gln）的二磷酸腺苷核糖基化（ADP-ribosylation）。这一修饰特异性地抑制V-ATPase与ATG16L1的相互作用，而不影响其质子泵的功能，从而特异地抑制宿主的异源自噬。

虽然早期的研究认为细菌入侵宿主细胞后是首先被泛素化标记而后被自噬识别【11】，但是人们一直未能找到细菌表面的泛素化靶蛋白，也未能找到引发这种泛素化的连接酶。邵峰课题组的上述研究表明细菌侵染导致的囊泡膜损伤是启动异源自噬的信号，而质子泵V-ATPase感知囊泡膜损伤并通过募集ATG16L1启动异源自噬。邵峰课题组通过探究细菌的“自我保护机制”揭示了宿主通过异源自噬清除入侵病原菌的识别和启动机制，同时发现了病原体抵御宿主清除的新途径，体现了独特的研究视角和系统优势。V-ATPase是否可作为“感知器”在其他囊泡膜损伤过程中发挥作用，并通过募集 ATG16L1启动自噬值得深入研究。

俞立（清华大学）：细胞可以通过异体自噬清除侵入细胞内的细菌，异体自噬的关键问题是细胞如何感知入侵的细菌，以及这一信息是如何特异地引起自噬。目前，关于异体自噬感知病原体的机制已有一些报道，然而，由于在大多数的模型中，异体自噬发生的频率很低，因此，很难对这些机制进行深入的研究，也很难评诂这些机制是否，或在多大程度上介导了异体自噬。

宿主和病原菌长期的共进化形成了宿主和病原菌间的军备竞赛，病原菌往往会进化出抑制宿主防御系统的机制，从这个思路出发，来自邵峰组的许悦等首先利用转座子系统筛选病原菌基因组中抑制异体自噬的基因，并发现SopF能抑制异体自噬（但并不抑制由于营养缺乏诱发的经典自噬），去除SopF的细菌感染后异体自噬的频率大大增加，利用类似的现象，作者进而对宿主细胞进行了CRISPR/Cas9介导的全基因组筛选，发现V-ATPase是引起异体自噬的关键元件，通过一系列机制研究，作者发现 在包含病原菌的宿主细胞囊泡损伤后，V-ATPase会招募ATG16L1，从而起始异体自噬，而SopF的存在则会彻底阻断V-ATPase对ATG16L1的招募。生化化学的研究发现SopF是一个核糖基转移酶，进一步利用ADP-核糖基化修饰组的方法，作者鉴定出SopF在宿主中的底物蛋白正是V-ATPase的V0C亚基，在病原菌侵入细胞后，SopF会特异性地ADP-核糖基化V0C蛋白的一个谷氨酰胺残基，从而阻断V-ATPase复合物对ATG16L1的招募， 导致对异体自噬的抑制。

除发现一个病原菌对异体自噬的抑制系统及异体自噬的一个必需元件外，这项工作为异体自噬领域研究引入了一系列重要的研究思路和方法，并对宿主细胞怎样感知胞内病原菌这一异体自噬领域的核心问题提供了一个同目前主流模型不同的方向，进一步研究V-ATPase感受病原菌的机制可能可以回答这一关键问题。此外，这项工作对异体自噬和选择性自噬的研究提出了很多有意思的问题，例如，其它选择性自噬，例如线粒体自噬，会存在类似的抑制系统吗？V-ATPase介导的异体自噬的起始同其他异体自噬的机制是怎样协同的？我们期待对这些重要问题的进一步研究。

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