近期，南京医科大学第一附属医院骨科任永信教授和北京大学深圳医院脊柱外科黄永灿副研究员在科爱出版创办的期刊 Bioactive Materials 上发表文章：人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡（hUCMSC-EVs）缓解黄韧带肥厚。该研究首先证明人黄韧带组织中miR-146a-5p 和 miR-221- 3p的表达与黄韧带的厚度呈负相关；随后证明hUCMSC-EVs可显著延缓纤维化进程，改善黄韧带肥厚。机制上，hUCMSC-EVs可传递miR-146a-5p 和 miR-221-3p 至黄韧带细胞，并靶向结合到 SMAD4 mRNA 的3'-UTR 区域，进而抑制 TGF-β/SMAD4 信号通路, 缓解黄韧带肥厚。该研究为基于hUCMSC-EVs的输送系统治疗黄韧带肥厚的临床转化奠定基础。

腰椎管狭窄症（LSS）是全世界老年人中最常见的脊柱疾病之一，患病率随年龄增长而增加，对患者日常生活造成严重的影响。黄韧带肥厚（LFH）已被发现是主要的病因之一，但尚无有效的缓解手段。作为治疗纤维化疾病的潜在候选细胞，人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）已被证明能缓解软骨炎症，并抑制肺、肝和肾纤维化。研究表明，间充质干细胞的大部分治疗效果来自于旁分泌的可溶性因子的释放，细胞外囊泡（EVs）作为细胞间交流的天然载体发挥了关键作用。作为有前途的药物递送载体，间充质干细胞衍生的EVs已被证明拥有治疗各种疾病的巨大潜能。EVs含有蛋白质、mRNA和miRNA，它们可以在细胞间通讯发挥巨大作用，影响目标细胞的蛋白质表达。由于EVs的低致瘤性、免疫原性和易操作性，在治疗纤维化疾病方面，EVs可以成为比其母体细胞更安全的治疗策略。但是hUCMSC-EVs是否能够预防LFH仍不清楚。本研究的主要目的是明确hUCMSC-EVs在治疗LFH方面的潜能和相关机制。

一、 LFH 的发展与 miR-146a-5p 和 miR-221-3p表达量的下调密切相关

为了研究 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 表达水平与 LF 厚度之间的相关性，我们利用MRI影像数据测量了LF 厚度，用 RT-qPCR 检测了术后黄韧带标本 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 的表达。如图 1A 所示，MRI 扫描证实LF 厚度 > 5 mm 的 LFH 影响了大部分椎管并导致严重的脊髓压迫；正常的 LF（厚度小于 5 mm） 并没有压迫脊髓。LFH 组LF的平均厚度为 6.565 ± 1.243 mm，远高于对照组 (3.021 ± 0.448 mm)。H&E和EVG染色结果显示，LFH组弹性纤维减少，胶原纤维增加，弹力纤维染成蓝黑色（EVG 染色）不均匀、碎裂、排列不规则、杂乱无章、部分缺失；在对照组中，弹性纤维丰富且排列整齐，胶原纤维很少。LFH组弹性纤维与胶原纤维的比例显着高于对照组；此外，RT-qPCR结果显示，LFH组miR-146a-5p和miR-221-3p表达水平显着低于对照组。因此，miR-146a-5p 和 miR-221-3p 表达水平与 LF 厚度呈负相关（图1）。

二、 miR-146a-5p和miR-221-3p在hUCMSC-EVs中富集

利用 miRNA-seq筛选hUCMSC-EVs 中的 miRNA表达谱，选取表达最丰富的五个miRNA为候选目标，即 miR-21-5p、miR-146a-5p、miR-221-3p、miR-143-3p 和 let-7i-5p，约占总 miRNA 读数的 60.47%。利用RT-qPCR 检测表明 miR-221-3p 和 miR-146a-5p 表达水平在 hUCMSC 和 hUCMSC-EV 组中最高。

随后，进一步测量了在 TGF-β1 和/或 hUCMSC-EV 作用下， LF 细胞中这五种 miRNA 的表达水平，结果表明hUCMSC-EVs 治疗使 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 表达水平分别显着增加 5.22 倍和 8.32 倍，揭示了miR-146a-5p 和 miR-221-3p 可能在 hUCMSC-EVs 对 TGF-β1 诱导的 LF 细胞纤维化的治疗作用中起关键作用（图2）。

三、 hUCMSC-EVs 抑制小鼠的 LFH ，改善小鼠 LF 细胞的纤维化

通过双足站立造成黄韧带肥厚的小鼠模型和利用TGF-β1刺激小鼠LF细胞纤维化的体外实验，利用CCK-8、RT-qPCR、WB、IF、IHC、H&E及EVG染色等方法，证明了hUCMSC-EVs 可抑制小鼠的 LFH ，改善小鼠 LF 细胞的纤维化（图3、4）。

四、MiR-146a-5p 和 miR-221-3p通过 EV 递送至 LF 细胞并改善 TGF-β1 诱导的纤维化

为了进一步研究 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 是否可以递送至 LF 细胞，该研究使用GW4869（一种囊泡抑制剂）作用细胞，将 Cy5 标记的 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 转染到 hUCMSCs 中。随后，使用transwell 培养皿将 LF 细胞与 hUCMSCs 共培养；48 小时后，使用 IF 染色检测 Cy5 阳性 LF。结果显示，对照组的荧光强度远高于 GW4869 组，这证实miR-146a-5p 和 miR-221-3p 通过 EVs 从 hUCMSCs 转移到 LF 细胞。随后发现hUCMSCs转染 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 抑制剂后，hUCMSC-EVs 中 miR-146a-5p 和 miR-221-3p 的表达水平显着降低。在应用TGF-β1 和hUCMSC-EV 的情况下，利用 RT-qPCR、蛋白质印迹和 IF 检测纤维化标志物（Col-I、α-SMA 和 Col-III）的表达水平，结果表明敲低EVs 中 miR-146a-5p 和/或 miR-221-3p 的表达能够显著降低hUCMSC-EVs 对 TGF-β1 诱导LF 细胞纤维化的治疗效果。因此，这些数据证实miR-146a-5p 和 miR-221-3p 在 hUCMSC-EVs 对 TGF-β1 诱导的 LF 细胞纤维化的治疗作用中起着关键的作用（图5）。

博士，骨科主治医师，南京医科大学第一附属医院在站博士后，主要从事软骨、椎间盘、黄韧带退变研究，相关研究工作在Bioactive Materials、Front Cell Dev Biol、eLife和Oxid Med Cell Longev等国际期刊上发表。

博士，主任医师、教授、博士生导师, 南京医科大学第一附属医院骨科行政副主任。主要从事脊柱退行性疾病、骨再生与修复等方面的基础和临床研究。主持国家自然科学基金3项，承担国家973项目（学术骨干），主持中德合作项目1项，江苏省自然科学基金项目1项等。近年来在Elife、Bioactive Materials和 Spine等杂志发表学术论文30余篇。

博士，北京大学医学部副研究员、硕士生导师，北京大学深圳医院骨病研究所副所长，深圳骨科疾病再生技术工程实验室主任。主要从事脊柱退行性疾病、胎盘来源活性材料与组织修复相关研究，近年来在Nature Reviews Rheumatology、Bioactive Materials、Bone Research等学术期刊上发表工作70余篇；主持国家自然科学基金、广东省自然科学基金和深圳市战略性新兴产业扶持计划等科研项目多项。

该研究获 国家自然科学基金(81572149) （81600697），广东省基础与应用基础研究基金（2021A1515220086），江苏省自然科学基金（K20201487），江苏省“333”项目(LGY2016001)，中德合作基金（M-0332）的支持。

Ma C, Qi X, Wei YF, Li Z, Zhang HL, Li H, Yu FL, Pu YN, Huang YC, Ren YX. 

Amelioration of ligamentum flavum hypertrophy using umbilical cord mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles. 

Bioactive Materials, 19 (2023) 139-154.

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